Purifikace oligonukleotidůOligonukleotid lze purifikovat od nežádoucích látek a artefaktů vzniklých v průběhu jejich syntézy - jedná se o chemické nečistoty (chránící skupiny a přebytek solí), popř. o kontaminaci řetězci oligonukleotidů nesprávné délky. V GENERI BIOTECH poskytujeme 3 typy purifikace - standardní, OPC a HPLC. Jednotlivé typy purifikace se liší jak čistotou výsledného produktu a tak výtěžkem.
Proč při syntéze vznikají řetězce nesprávné délky?Pro syntézu oligo je charakteristické, že coupling (navázání nové baze na rostoucí oligonukleotid) neprobíhá se 100 % účinností, a to ani při optimálních reakčních podmínkách. Výsledkem je kontaminace produktu určitým podílem krátkých nedosyntetizovaných řetězců.
V případě dlouhých oligo (nad 50 bazí) může podíl řetězců plné délky klesnout i pod 50 %. V takovém případě je vhodné provést purifikaci schopnou odstranit kratší nedosyntetizované řetězce.
Typy purifikace oligonukleotidů:Rozlišujeme následující typy purifikace oligonukleotidů, které se liší v metodice i kvalitě výsledného produktu: - standardní purifikace: Oligonukleotid je po deprotekci odsolen na koloně naplněné většinou médiem Sephadex G-25. Oligonukleotid (jako molekula o vysoké molekulové hmotnosti) proteče kolonou, menší molekuly (chránící skupiny, přebytek solí a pod.) zůstanou v pórech média. Produkt je zbaven pouze chemických nečistot s poměrně nízkými ztrátami.
- OPC purifikace: Je založena na zachycení oligonukleotidů obsahujících na svém 5´ konci tritylovou skupinu na lipofilním sorbentu OPC sloupce (Oligonucleotide Purification Cartridge). Tritylová skupina je po ukončení syntézy oligo přítomna jen na plně dosyntetizovaných řetězcích, které jsou v posledním kroku purifikace eluovány v čisté podobě (bez tritylu)
- HPLC purifikace: Oligonukleotid je separován na vysoce účinných reverzních nebo ionexových kolonách podle afinity molekul k sorbentu. Jedná se o nejúčinnější metodu purifikace.
Garantované a obvyklé výtěžky jednotlivých typů purifikací: | | garantovaný výtěžek (obvyklý výtěžek) [nmol]* | | Scale | standardní purifikace | OPC purifikace | HPLC purifikace | | 40 nmol | 20-40 (35-40) | 10-35 (30-35) | 5-20 (10-35) | | 200 nmol | 60-180 (130-150) | 40-100 (45-130) | 20-50 (25-100) | | 1 µmol | 300-500 (350-500) | 100-300 (200-300) | 50-200 (100-250) | | * Platí pro nemodifikované sekvence o délce 15-50 bazí |
|
|
