Syntéza oligo a její výtěžekSyntéza oligonukleotidů in vitro se v GENERI BIOTECH provádí tzv. fosforamiditovou metodou, jejíž princip spočívá v cyklickém blokování reaktivních skupin rostoucího oligonukleotidu chránícími molekulami a jejich následném odkrývání za účelem připojení další baze. Výsledný produkt nemá fosfátovou skupinu na žádném z obou konců. Proces probíhá v obráceném směru než in vivo (tedy od 3´ konce k 5´ konci) na pevném podkladu nesoucím zakotvený 3´ koncový nukleotid. Oliga jsou syntetizována z nukleotidových prekurzorů nesoucích na 5´ konci tritylovou skupinu. V každém cyklu syntézy, který je složen asi ze 100 kroků, dochází k detritylaci rostoucího řetězce oligonukleotidu, připojení nového nukleotidu (coupling), oxidaci vzniklé fosfitové vazby na fosfátovou a zablokování nezreagovaných 5´ koncových skupin rostoucího oligo (capping). Proces může být plně automatizován a provádí se s pomocí tzv. syntetizérů.
Výtěžek syntézyPro syntézu oligo je charakteristické, že coupling (navázání nové báze na rostoucí oligonukleotid) neprobíhá se 100 % účinností, a to ani při optimálních reakčních podmínkách. Výsledkem je kontaminace produktu určitým podílem krátkých nedosyntetizovaných řetězců. V GENERI BIOTECH syntéza běžně probíhá s účinností 99 %. Tabulka: Výtěžek syntézy oligo při 99 % účinnosti couplingu
| | délka oligo | zastoupení produktu | zastoupení nečistot | | 10 bazí | 91 % | 9 % | | 20 bazí | 83 % | 17 % | | 50 bazí | 61 % | 39 % | | 75 bazí | 48 % | 52 % | | 100 bazí | 37 % | 63 % |
|
Při objednávce syntézy dlouhých oligo (nad 40 bazí), je zapotřebí počítat s relativně nižším podílem oligonukleotidů správné délky. Pro odstranění kratších nedosyntetizovaných řetězců GENERI BIOTECH poskytuje OPC nebo HPLC purifikaci oligo. Výtěžek syntézy závisí nejen na délce řetězce, scale syntézy a použité purifikační metodě, ale i na složení řetězce. Řetězce s vysokým zastoupením G a A, které mají nižší coupling, poskytnou znatelně nižší výtěžek než řetězce s vysokým podílem C a T. Nejniží výtěžek mají čisté řetězce polypurinů.
Syntéza modifikovaných oligo Modifikující molekuly jsou k řetězci oligonukleotidu obvykle připojovány prostřednictvím několikauhlíkového spaceru, aby se zabránilo nepříznivému sterickému bránění.
3´ modifikující skupina se vnáší do oliga na syntetizační koloně, kterou je potřeba zpravidla manuálně vyrobit v nejmenší scale 200 nmol. 5´ modifikující skupina se vnáší do oliga po proběhlé syntéze řetězce jako další krok syntézy.
|
