Požadavky na kvalitu PCR produktu
PCR produkt dodaný od zákazníka je využíván buď k přípravě PCR standardu nebo k sekvenaci samotného produktu. Ke správnému provedení obou služeb je zapotřebí, abychom měli k dispozici následující informace o PCR produktu: - specifikaci polymerázy, kterou byl produkt amplifikován (potřebujeme znát především pro přípravu standardu)
- fotografii po elektroforéze (včetně délkového markeru a jeho specifikace)
- zda byl produkt přečištěn některým purifikačním kitem
Fotografie po elektroforéze slouží k odhadu množství PCR produktu. Jedná se o elektroforézu alikvotu již izolovaného a přečištěného vzorku na agarózovém gelu. Obvykle se pracuje se 3-5 µl PCR produktu a s takovým množstvím délkového markeru, které podle pokynů výrobce umožní odečtení koncentrace DNA.
V případě Vašeho zájmu můžeme provést s PCR produktem dodatečné kroky. Obvykle se jedná o purifikaci nebo izolaci PCR produktu z gelu. Můžeme dokonce zajistit i celou amplifikaci produktu, když nám zákazník dodá primery nebo jejich sekvence. Pokud se jedná o sekvenci jiného organismu než lidského, potkaního nebo myšího, je třeba dodat i templátovou DNA (cDNA). Všechny námi provedené kroky, které jsou nutné k tomu, aby měl PCR produkt odpovídající kvalitu pro klonování nebo sekvenaci jsou účtovány navíc. Proto je v takových případech nutné konzultovat zakázku předem. Některé z výše uvedených požadavků demonstrujeme na následujících příkladech:
Obrázek č. 1: Odhad koncentrace PCR produktu. Naneseny byly 4 l vzorku (po izolaci a purifikaci) a 0,5 g délkového DNA markeru. Dostačující koncentrace: dráhy č. 1, 2, 4 a 8. Hraniční koncentrace: dráha č. 5. Nedostatečná koncentrace: dráhy č. 3, 6 a 7. Tato fotografie nás zajímá především!
Obrázek č. 2: Elektroforéza PCR produktu po amplifikaci za různých podmínek. Pro další účely je nejvhodnější izolovat produkt v dráze č. 4.
Obrázky č. 3 a 4: Elektroforéza zdánlivě homogenního silného proužku PCR produktu. Je nutné, aby došlo ke kvalitnímu rozdělení proužků na gelu a nebyl bezdůvodně zkracován čas elektroforézy, jinak hrozí izolace heterogenního vzorku.
|
