Základní principy kvantitativní real-time PCR (qPCR)Metoda kvantitativní real-time PCR (qPCR) je moderní technika molekulární biologie umožňující rychlou, citlivou a spolehlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA. Stala se tak proto neocenitelným nástrojem pro detekci specifických mikroorganismů a kvantifikaci genové exprese. Amplifikace DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) spočívá v opakované replikaci úseku DNA ohraničeného specifickými primery pomocí termostabilní DNA polymerázy (zpravidla Taq polymerázy izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus) procesem teplotního cyklování. V každém cyklu dochází v ideálním případě ke zdvojení amplifikované sekvence, jejíž množství tak exponenciálně roste. Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) přímo během reakce (tzv. „v reálném čase") pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Její výhodou oproti konvenční PCR je možnost přesného stanovení výchozícho počtu kopií cílové templátové sekvence DNA, čili schopnost kvantifikace. Real-time PCR se provádí s pomocí přístrojů zvaných cyclery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR. Fluorescence je měřena během každého cyklu PCR a její intenzita je přímo či nepřímo úměrná množství amplifikátu přítomného v reakční směsi. Kvantifikace se provádí prostřednictvím matematické analýzy amplifikačních křivek vzniklých vynesením naměřené fluorescence oproti pořadovému číslu příslušného cyklu. Typická amplifikační křivka má esovitě zakřivený tvar a lze ji rozdělit na 3 části: 1) „background" fázi kdy je amplifikátu tak málo, že jeho fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot; 2) exponenciální fázi, kdy množství produktu exponencielně roste (trvá asi 4-8 cyklů) a 3) fázi plató, kdy dochází k saturaci systému, množství amplifikovaného produktu se dále nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní. Platí, že čím dříve amplifikační křivka dosáhne exponenciální fáze, popř. překročí určitý fluorescenční práh umístěný do této fáze, tím více startovních templátových molekul bylo přítomno ve vzorku na počátku reakce.
Real-time PCR kvantifikacePoužívané matematické modely pracují s hodnotou zvanou CT („threshold cycle"), která se rovná cyklu, kdy amplifikační křivka překročí zmíněný fluorescenční práh umístěný do exponenciální fáze reakce. Absolutní kvantifikace, která se používá např. při detekci specifických mikroorganismů, přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul. Je založena na zjištění, že existuje lineární vztah mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a CT příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibační přímku („standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku. Relativní kvantifikace, která se používá ke stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky. Porovnává se relativní změna genové exprese (relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku, kterým může být např. mRNA neovlivněných buněk a pod. CT amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti CT housekeeping genu. Při kvantifikaci mRNA (měření genové exprese) se před vlastní PCR provádí reversní transkripce - přepis mRNA do tzv. cDNA (RT-PCR), která je následně amplifikována.
Detekční systémyPrvními látkami používanými pro detekci akumulace produktu během real-time PCR reakce byla interkalační barviva (ethidium bromid, SYBR Green I), jeichž fluorescenční aktivita vzrůstá po vazbě na dvouřetězcovou DNA. Vzhledem k tomu, že během PCR vzniká dvouřetězcový produkt, jehož množství zpravidla výrazně převyšuje počáteční množství dsDNA, lze pomocí interkalačních barviv sledovat průběh amplifikace. Velkou nevýhodou interkalačních barviv je skutečnost, že detekují veškerou dsDNA přítomnou v reakční směsi včetně nespecifických produktů amplifikace (jako jsou např. tzv. primer-dimer artefakty), které i při velmi pečlivé optimalizaci metody velmi často vznikají. Specifita detekce je navíc dána pouze sekvencemi primerů. Elegantní řešení co se týče detekce nespecifických produktů nabízejí často využívané oligonukleotidové sondy. Jedná se o fluorescenčně značené oligonukleotidy, které hybridizují s určitou cílovou sekvencí uvnitř amplifikovaného regionu a výrazně přitom zvyšují svou fluorescenční aktivitu. Jejich výhodou je vysoká specifita, jelikož detekce cílové sekvence probíhá ve 2 stupních - na úrovni vazby primerů a rovněž na úrovni vazby sondy.
Analýza křivky táníAnalýza křivky tání je metoda, která se používá po ukončení real-time PCR reakce ke zjištění povahy produktů PCR. Ve spojení s oligonukleotidovými sondami lze s její pomocí provádět detekci SNP polymorfismů a mutační analýzu vůbec, při použití interkalačních barviv se metoda používá k odlišení specifických a nespecifických produktů PCR reakce. Jako tání DNA označujeme proces separace komplementárních řetězců dsDNA indukovaný zvyšováním teploty. Platí, že DNA taje nejrychleji v určitém rozsahu teplot blížících se tzv. teplotě tání Tm. Tání DNA můžeme po skončení real-time PCR reakce sledovat tak, že roztok dsDNA ochladíme na teplotu nižší než je očekávaná Tm produktů, postupně ohříváme na teplotu vyšší než je očekávaná Tm a měříme přitom fluorescenci. Platí, že fluorescenční aktivita oligonukleotidové sondy nebo interkalačního barviva je přímo úměrná množství dsDNA přítomné v reakční směsi. Pokud vyneseme naměřenou intenzitu fluorescence proti příslušené teplotě, dostaneme tzv. křivku tání, která náhle strmě klesá v okolí Tm. Teplota v inflexním bodě křivky se rovná teplotě tání a lze ji snadno zjistit zderivováním křivky tání, kde se v grafu objeví jako vrchol „peaku". Detekce SNP polymorfismů pomocí oligonukleotidových sond je založena na skutečnosti, že i jediná nekomplementární báze velmi změní Tm sondy, přičemž sonda nekomplementární taje při nižšní Tm než sonda plně komplementární. Detekce nespecifických produktů při použití interkalačních barviv využívá předpokladu, že nespecifické produkty mají odlišnou (obvykle nižší) Tm než produkty specifické.
Multiplexní real-time PCRMultiplexní PCR se vyznačuje amplifikací více odlišných úseků DNA současně v jedné reakční kyvetě. Metoda používá několik párů primerů s odlišnou specifitou v jedné reakci. Umožňuje simultánní detekci několika úseků nukleových kyselin - např. detekci více druhů mikroorganismů najednou, společnou detekci cílového genu a housekeeping genu nebo zavedení interních kontrol do reakce. Multiplexní aplikace jsou výhodné z hlediska úspory času a nákladů pro analýzu. Multiplexní real-time PCR je možné provádět pouze ve spojení s oligonukleotidovými sondami. Každý amplifikovaný region má vlastní set primerů a sondy, přičemž detekční flurofory jednotlivých sond se navzájem liší emisními spektry.
|
