Real-time PCR sondy vs. SYBR Green I
SYBR Green I je dsDNA specifické interkalační barvivo, jehož použití v real-time PCR systémech je založeno na předpokladu, že po několika cyklech PCR by majoritní část dsDNA v reakční směsi měla být tvořena produktem amplifikace a fluorescence emitovaná molekulami SYBR Green I by tedy měla reflektovat množství přítomného produktu. V GENERI BIOTECH jsme mnohokrát experimentálně ověřili, že reálné výsledky při použití SYBR Green I teoretickým předpokladům neodpovídají. I při velmi pečlivém designu primerů a optimalizaci reakčních podmínek je téměř nemožné vyhnout se vzniku primer-dimer artefaktů a jiných nespecifických produktů, které jsou prostřednictvím SYBR Green I detekovány spolu s žádoucím produktem, a zkreslují naměřená CT a následně výsledné koncentrace neznámých vzorků. Na základě výsledků vlastních experimentů GENERI BIOTECH používá a dodává výhradně real-time PCR systémy v uspořádání s oligonukleotidovými sondami zajišťujícími vysokou specifitu. V případě oligonukleotidových sond probíhá zacílená detekce určité sekvence ve 2 krocích - za prvé na úrovni vazby primerů a za druhé na úrovni vazby sondy na komplementární sekvenci uvnitř amplifikovaného regionu. Tím je zajištěna vysoká specifita, protože je velmi nepravděpodobné, že by následkem nespecifické vazby primerů vznikal artefakt obsahující cílovou sekvenci sondy. Pokud tedy sonda zvýší svou fluorescenční aktivitu, je to vždy proto, že specificky hybridizovala s produktem amplifikace. Příklady z praxe:- SYBR Green I: často se stává, že amplifikační křivky vzorků s nízkými templátovými koncentracemi jsou pouze produktem fluorescenční aktivity primer-dimerů a jiných nespecifických artefaktů. Vznik nespecifických produktů amplifikace sice lze odhalit pomocí analýzy křivky tání, nicméně hodnoty CT jsou zkreslené a neodpovídají koncentracím vzorků.
- oligonukleotidové sondy: detekují pouze specifický produkt PCR amplifikace - CT amplifikačních křivek proto nejsou zkreslena detekcí primer-dimerů a jiných nespecifických artefaktů.
|
