ENG 
CZE 
C8-Alkyne-dT
Používá se ke konjugacím tzv. „Click chemií." Může být navázán k oligonukleotidu kdekoliv v řetězci s výjimkou 3' konce.
Definice a charakteristika
Analoga bazí představují chemicky upravené varianty přirozených nukleotidů – adeninu (A), cytosinu (C), guaninu (G) a thyminu (T) – které si zachovávají schopnost komplementárního párování, avšak vykazují specifické chemické a strukturální vlastnosti. V sekvenačních postupech mohou tyto modifikace minimalizovat zkreslení amplifikace, zlepšovat detekční vlastnosti prostřednictvím fluorescenčních signálů či sloužit jako markery pro identifikaci poškození nebo modifikací DNA.
Ačkoli se pojem „analoga bazí“ tradičně vztahuje na synteticky připravené nukleotidy, současné aplikace NGS zahrnují rovněž přirozeně se vyskytující modifikace, jako je metylace nebo oxidace bazí, které hrají zásadní roli v epigenetické regulaci genové exprese a ve stabilitě genomu.
| Analoga bazí | Baze | Funkce / Využití v kontextu NGS |
| 7-Deaza-dG/dA | Guanin / Adenin | Snižuje tvorbu sekundárních struktur (např. G-kvadruplexy); zvyšují účinnost PCR reakce |
| 8-Oxo-dG | Guanin | Marker oxidačního poškození DNA; může se párovat chybně s A |
| 5-Methyl-dC | Cytosin | Epigenetická značka; detekována pomocí WGBS (celogenomové bisulfitové sekvenování) |
| 5-Hydroxymethyl-dC | Cytosin | Další epigenetická modifikace; rozlišována pomocí oxBS-seq, TAB-seq |
| BrdU (Bromodeoxyuridin) | Thymin | Používán při studiích buněčné proliferace; občas sledován sekvenováním (NGS) nebo IP-seq |
| EdU (Ethynyldeoxyuridin) | Thymin | Analoga pro značení replikující se DNA – užitečný v sekvenačních studiích buněčného cyklu |
| dU (Deoxyuridin) | Náhrada za thymin | Nachází se v UDG-založených DNA opravách a workflows jako damage-seq |
| dI (Deoxyinosin) | Analoga purinů | Mohou se párovat s více bazemi – někdy používána v degenerovaných primerech |
| Biotin-dUTP | Thymin | Používán pro značení DNA fragmentů, např. v ChIP-seq nebo pull-down experimentech |
| 6-MI (6-Methylisoxanthopterin) | Guanin | Fluorescenční analoga – někdy používána v strukturálních nebo kinetických NGS analýzách |
Analoga bazí v pracovních postupech NGS
-
Zlepšení amplifikace a pokrytí genomu
Amplifikace oblastí DNA s vysokým obsahem GC nebo složitou sekundární strukturou představuje technickou výzvu z důvodu tvorby stabilních útvarů, jako jsou G-quadruplexy. Analoga, například 7-deaza-dG a 7-deaza-dA, omezují vznik těchto struktur, čímž zvyšují účinnost PCR reakce a zajišťují rovnoměrnější pokrytí obtížně amplifikovatelných genomových úseků.
-
Detekce poškození a opravy DNA
Oxidativní analoga 8-oxo-dG představují významný biomarker poškození DNA, která mají tendenci chybně se párovat s adeninem. Jejich detekce v rámci sekvenačních experimentů umožňuje sledovat úroveň oxidačního stresu, mechanismy mutageneze a procesy opravy DNA, což je zásadní pro pochopení molekulárních mechanismů onemocnění i pro hodnocení integrity biologických vzorků.
-
Profilování epigenetických modifikací
Analoga cytosinu, jako 5-methyl-deoxycytidin (5-methyl-dC) a 5-hydroxymethyl-deoxycytidin (5-hydroxymethyl-dC), tvoří základ pokročilých epigenomických sekvenačních metod. Techniky typu bisulfitové sekvenování celého genomu (WGBS) a oxidační bisulfitové sekvenování (oxBS-seq) umožňují rozlišení jednotlivých modifikací cytosinu a tím i detailní mapování metylačních vzorců s přesností na úrovni jednotlivých bazí. Tyto postupy významně přispívají k pochopení epigenetických mechanismů určujících buněčnou identitu a patofyziologické stavy.
-
Studium replikace DNA a buněčné proliferace
Thymidinové analoga, zejména bromodeoxyuridin (BrdU) a ethynyldeoxyuridin (EdU), jsou inkorporovány do nově syntetizovaných řetězců DNA, čímž označují aktivní replikační oblasti. V kombinaci se sekvenačními nebo imunoprecipitačními metodami umožňují sledování časování replikace a dynamiky buněčného cyklu v měřítku celého genomu. Tyto informace jsou klíčové pro biomedicínský výzkum i vývoj terapeutických strategií.
-
Značení DNA a strukturální analýzy
Analoga, jako biotin-deoxyuridintrifosfát (biotin-dUTP) či fluorescenční marker 6-methylisoxanthopterin (6-MI), umožňují zavedení funkčních nebo fluorescenčních značek do molekul DNA. Tyto modifikace se široce využívají v pull-down experimentech (např. ChIP-seq) a při fluorescenčních studiích v reálném čase, kde přispívají k rozvoji pokročilých biochemických a strukturálních analýz.
Analoga bazí představují významný nástroj pro rozšiřování analytických možností sekvenování nové generace. Umožňují nejen zvýšení přesnosti a efektivity sekvenačních postupů, ale také hlubší porozumění strukturálním, epigenetickým a funkčním aspektům genomu. Jejich integrace do moderních sekvenačních protokolů tak otevírá nové perspektivy v genomice, epigenetice i molekulární medicíně.
