LNA – jak zvýšit afinitu a specifitu oligonukleotidů?

LNA představuje optimální volbu pro aplikace vyžadující maximální citlivost, specificitu a stabilitu. Díky svým unikátním vlastnostem patří mezi nejpoužívanější modifikace v moderní molekulární biologii, diagnostice i vývoji nukleových terapeutik, kde často narážíme na limity přirozených nukleových kyselin. Při detekci velmi krátkých sekvencí, jako jsou mikroRNA (miRNA), nebo při snaze o rozlišení jednonukleotidových polymorfismů (SNP) nemusí standardní DNA nebo RNA sondy poskytovat dostatečnou vazebnou afinitu a specifitu. Řešením, které tyto termodynamické a strukturní překážky překonává, je začlenění LNA do sekvence oligonukleotidů.

Co je to LNA a jak přesně funguje?

LNA, moderní chemická modifikace nukleových kyselin, při které je ribózový kruh „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2′-O a 4′-C. Tato strukturální úprava (fixace ribózy do C3′-endo konformace – tzv. N-typ),  výrazně zlepšuje vlastnosti oligonukleotidů ve srovnání s běžnou DNA nebo RNA.

Kde LNA přináší zásadní výhodu?

• Kvantitativní PCR (qPCR) a detekce krátkých cílů: běžná TaqMan sonda vyžaduje pro optimální Tm (obvykle kolem 68–70 °C) délku 20 až 30 nukleotidů. Pokud detekujete miRNA, které mají samy o sobě délku kolem 21–23 nukleotidů, standardní sonda jednoduše nefunguje. LNA umožňuje navrhnout velmi krátké sondy (klidně 13–15 bazí), které si udrží vysokou Tm a bez problémů hybridizují na krátké cíle.
• Genotypizace a detekce SNP: kratší sonda znamená, že jediný mismatch tvoří větší procentuální podíl z celkové délky hybridizační oblasti. Umístěním LNA monomeru přímo na místo očekávané mutace (nebo do jeho těsné blízkosti) získáte sondu, která na wild-type sekvenci nasedne pevně, ale mutovanou sekvenci zcela ignoruje.
• In situ hybridizace (ISH) a Northern blotting: vysoká afinita LNA sond umožňuje použití přísnějších podmínek promývání, což dramaticky snižuje šum pozadí a zvyšuje specifičnost signálu při detekci RNA přímo ve tkáňových řezech nebo buňkách.

Zakázková syntéza LNA v GENERI BIOTECH

GENERI BIOTECH vyrábí LNA přímo v rámci svého portfolia modifikovaných oligonukleotidů. Tyto produkty lze jednoduše objednat i jako sekvence sondového typu. To znamená, že si v rámci jedné zakázky můžete nechat nasyntetizovat oligonukleotid, který obsahuje cíleně rozmístěné LNA monomery, a zároveň je na jeho koncích (či uvnitř sekvence) navázán požadovaný fluorofor a zhášeč (např. pro zmíněné TaqMan sondy).

Vývoj a syntéza probíhají v přísně kontrolovaných podmínkách, což garantuje vysokou reprodukovatelnost mezi jednotlivými šaržemi, zároveň u nás máte jistotu rychlých dodávek, certifikované kvality a dostupné expertní podpory.

Nabízíme syntézu oligonukleotidů obsahujících LNA modifikace včetně individuálního návrhu sekvencí a kombinací s dalšími úpravami, jako jsou fluorofory, quenchery, fosforothioátové vazby a další.

V případě zájmu nás kontaktujte – rádi Vám pomůžeme najít optimální řešení pro Vás projekt.

Lucie Nožková

Leona Hofmeisterová